“TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE CLOROPLASTOS DE TABACO CON LOS GENES CEL9A DE PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM Y MFC DE AMPULLARIA CROSSEAN"

REYES CARAVEO, YANEIRY JASMIN (2021) “TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE CLOROPLASTOS DE TABACO CON LOS GENES CEL9A DE PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM Y MFC DE AMPULLARIA CROSSEAN". Doctorado thesis, UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIHUAHUA.

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Resumen

La producción de enzimas recombinantes a partir de la transformación plastídica utilizando plantas de tabaco como biorreactores, ha emergido por su capacidad de producir proteínas a gran escala. La transformación genética del cloroplasto se ha ido implementando y desarrollado abriendo diversas áreas en las que destaca la agricultura, biocombustibles y farmacéutica. La producción de proteínas recombinantes para el uso humano por medio de biorreactores “verdes” tiene muchas ventajas como nulos efectos de posición, la ausencia de efectos epigenéticos y la posibilidad de contener los transgenes. En esta investigación se reportan las condiciones para generar dos líneas genéticamente modificadas de N. tabacum a partir de la inserción de genes en el genoma de cloroplasto utilizando el vector pRCY-1 que contiene el gen de Cel9A que codifica para una endoglucanasa de Panerochaete chrysosporium y pRCY-2 que contiene el gen mfc que codifica para una celulasa multifuncional proveniente de Ampullaria crossean. Ambos transgenes están dirigidos por el promotor rrn (del operon ARN) que contiene un terminador rbcL y un gen de resistencia aadA a espectinomicina/estreptomicina, además de las regiones de recombinación homóloga para cloroplasto de tabaco rrn16S/3ʹrps12 dirigido hacia la región de repetidos invertidos. La transformación se llevó a cabo a partir de hojas de tabaco por la técnica de biobalística obteniendo brotes a la quinta semana del bombardeo en medio suplementado con espectinomicina, posteriormente los callos obtenidos se sometieron a tres rondas de selección. De las plantas en tercera selección se eligió una línea para cada uno de los genes y se realizaron análisis de integración mediante primers específicos confirmando la integración plastidal en las plantas de tabaco. El sistema descrito en este proyecto puede ser utilizado como base para el mejoramiento genético de plantas de tabaco en la producción de enzimas hidrolíticas para la obtención de biocombustibles a partir de biomasa vegetal.

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